Qalabka FastKing RT (oo leh gDNase)

A-1 RNA waa la liidaa

——Ka nadiifi RNA tayo sare leh oo aan lahayn faddarayn. Maaddada laga soo saaro RNA waa inay noqotaa mid cusub intii suurtogal ah si looga hortago xaalufinta RNA. Falanqee hufnaanta RNA ee ku jirta jel -ka -beenaadka kahor falcelinta RT. Soo saaridda RNA ka dib, waa in lagu kaydiyaa 100% formamide. Haddii la isticmaalo ka -hortagga RNase, heerkulka kululayntu waa inuu ahaado <45 ° C, pH -na waa inuu ka yaraadaa 8.0, haddii kale ka -hortagaha ayaa sii deyn doona dhammaan RNase ku xidhan. Waxaa intaa dheer, ka -hortagga RNase waa in lagu daraa xalal ay ku jiraan ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA waxaa ku jira xannibaadaha falcelinta qoraalka gadaal

—— Dib -u -celiyeyaasha gadaal -ka -noqoshada waxaa ka mid ah SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, cusbada guanidine, iwm. Isku qas RNA -ga xakamaynta muunadda, oo isbarbardhig dhalidda iyo falcelinta RNA ee koontaroolka si aad u hubiso haddii uu jiro ka -hortag. Ku dhaq roobka RNA 70% (v/v) ethanol si meesha looga saaro wax -ka -hortagayaasha.

A-3 Daboolid aan ku filnayn raasamaalka loo adeegsaday isku-darka qaybtii ugu horreysay ee cDNA

——Qaar in heerkulka daboolku uu ku habboon yahay raasamaalka loo adeegsaday tijaabada. Hexamers -ka aan kala sooca lahayn, waxaa lagu talinayaa in heerkulka lagu hayo 25 ° C 10 daqiiqo kahor intaan la gaarin heerkulka falcelinta. Astaamaha hiddaha-gaarka ah (GSP), isku day GSP kale, ama u beddel oligo (dT) ama hexamer aan kala sooc lahayn.

A-4 Qadar yar oo ah RNA bilawga ah

——In la kordhiyo xaddiga RNA. Muunadaha RNA ee ka yar 50 ng, 0.1 μg ilaa 0.5 μg acetyl BSA waxaa loo adeegsan karaa isugeynta cDNA

A-5 Taxanaha bartilmaameedka laguma sheegin unugyada la falanqeeyay.

—— Tijaabi unugyada kale.

Falcelintii PCR-A-6 way guuldaraysatay

—— Laba-tallaabo RT-PCR, shaxanka cDNA ee tallaabada PCR kama badnaan karo 1/5 ee mugga falcelinta.

A-1 Ku-shubis aan gaar ahayn oo asaasiga iyo sheybaarada ah

—— Dhammaadka 3'-dhammaadka raasumaalka waa inaysan ku jirin 2-3 dG ama dC. U adeegso jaangooyooyin gaar u ah hiddo-wadaha xarigga ugu horreeya halkii aad ka isticmaali lahayd raasamaal aan kala sooc lahayn ama oligo (dT). Isticmaal heerkulka sifeynta sare ee wareegyada yar ee ugu horreeya, ka dibna heerkul daboolid hoose. U isticmaal bilow-kulul Taq DNA polymerase PCR-ga si loo wanaajiyo gaar ahaanshaha falcelinta.

A.

—— Raac isla mabaadii'da loogu talagalay xoojinta naqshadeynta asaasiga ah.

A-3 RNA wuxuu ku sumoobay DNA-ga hidde-wadaha

——Ku Daawee RNA oo leh fasalka PCR-fasalka DNase I. Samee falcelin koontarool ah iyada oo aan dib loo qorin si loo ogaado faddaraynta DNA.

A-4 Aasaasidda sumad hoose

——Qorshee naqshadeeyayaal aan lahayn isku xigxigyo dhammaystiran 3 -da dhammaad.

A-5 Mg aad u sarreeya²⁺ foojignaan

——Kordhi Mg²⁺ diirad -saaridda template kasta iyo isku -darka asaasiga ah

A-6 Oo ku sumoobay DNA shisheeye

—— Adeegso talooyinka aerosol-ka u adkaysta iyo enzymes-ka UDG.

J

——Soo yaree qaddarka alaabada ugu horreysa ee tallaabada falcelinta PCR ee caadiga ah.

A-2 Qaddarka asaasiga ah ee aadka u sarreeya ee falcelinta PCR

——Ka yaree fikradaha asaasiga ah.

A-3 Wareegyo aad u badan

——Ku wanaaji xaaladaha falcelinta PCR oo yaree lambarka wareegga PCR.

A-4 Heerkulka dabaysha oo aad u hooseeya

——Soo kordhi heerkulka siilka si looga hortago bilowga iyo fidinta aan gaarka ahayn.

A.

RT-PCR waa in dib loogu rogo RNA-ga loo rogo cDNA, ka dibna loo adeegsado cDNA-ka dib loo rogay sida template loogu talagalay falcelinta PCR si loo xoojiyo jajabka bartilmaameedka. Dooro midkood rasiidhada aan kala sooca lahayn, Oligo dT iyo hiddo -wadeyaasha gaarka ah sida waafaqsan xaaladaha gaarka ah ee tijaabada. Dhammaan alaabooyinka kor ku xusan waxaa loo isticmaali karaa mRNA unug eukaryotic ah oo aan lahayn qaab -dhismeed timaha.

Horudhac Random: Ku habboon RNA dheer oo leh qaab-dhismeedka timaha, iyo sidoo kale dhammaan noocyada RNA sida rRNA, mRNA, tRNA, iwm Waxay badiyaa loo adeegsadaa falcelinta RT-PCR ee hal shay.

Oligo dT: Ku habboon RNA oo leh dabada PolyA (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA iyo tRNA ma laha dabo PolyA). Sababtoo ah Oligo dT waxay ku xidhan tahay dabada PolyA, tayada shay-baarka RNA waxaa laga rabaa inay sarreyso, oo xitaa qadar yar oo xaalufintu waxay si weyn u yareyn doontaa xaddiga isku-darka cDNA ee dhererka buuxa.

Horudhaca hiddo-gaarka ah: Dhammaystirka taxanaha tusaalaha, ku habboon xaaladaha la ogyahay taxanaha bartilmaameedka.

Waxaa jira laba siyaabood:

1. Habka tixraaca gudaha: Aragti ahaan, cDNA waa jajabka DNA ee dhererka kala duwan, sidaa darteed natiijada electrophoresis waa smear. Haddii tirada badan ee RNA ay hooseyso, ma jirto badeecad ka dhex muuqan doonta electrophoresis, laakiin tani micnaheedu maahan in badeecad aysan weyneyn PCR. Guud ahaan, tixraaca gudaha waxaa loo isticmaali karaa in lagu ogaado cDNA. Haddii tixraaca guduhu uu leeyahay natiijooyin, tayada cDNA asal ahaan waa la damaanad qaadi karaa (dhowr xaaladood, haddii jajabka hidda -wadaha la beegsanayo uu aad u dheer yahay, waxaa jiri kara ka -reebitaan).

2. Haddii uu jiro hidde -sidaha la yaqaan oo lagu kordhiyay qaab -dhismeedkan, waxaa xaqiijin kara aasaaska hidda -wadaha. Ballaarinta tixraaca gudaha micnaheedu maahan inaysan jirin wax dhibaato ah oo ku saabsan cDNA. Sababtoo ah tixraaca gudaha wuxuu ku badan yahay cDNA, way fududahay in la kordhiyo. Haddii cDNA qayb ahaan loo liido sababo kala duwan awgood, marka laga eego dhinaca ixtimaalka, natiijooyinka PCR ee hidda -wadayaasha bartilmaameedka badan ayaa si weyn u saamayn doona. In kasta oo tixraaca gudaha uu weli yahay mid aad u tiro badan, weyneynta malaha ma saameyn doonto.

Qayb ahaan hoos u dhiga RNA. Soo ogow daacadnimada iyo nadiifinta RNA

Waxyaabaha ku jira RNA ee noocyada kala duwan way kala duwanaan karaan, laakiin guud ahaan, wadarta RNA ee la soo saaray waa inay ku jirtaa laba cad oo 28S iyo 18S ah oo ku jira electrophoresis gel, iyo dhalaalka kooxda hore waa inay laba jibaar ka sarraysaa tan dambe. Kooxda 5S waxay tilmaamaysaa in RNA la bahdilay, dhalaalkeeduna uu u dhigmo heerka xaalufinta. Kordhinta guuleysiga ee tixraaca gudaha micnaheedu ma aha in aysan wax dhibaato ah ku qabin RNA, maxaa yeelay tixraaca gudaha ayaa aad u badan, RNA waa la kordhin karaa ilaa inta hoos u dhaca uusan ahayn mid daran. OD₂₆₀/OD₂₈₀saamiga RNA saafi ah oo lagu cabiray spectrophotometer waa inuu u dhexeeyaa 1.9 iyo 2.1. Qadar yar oo nijaasta borotiinka ah ee RNA ayaa yarayn doonta saamiga. Ilaa inta qiimaha uusan aad u hooseyn, RT ma saameyn doonto. Waxa ugu muhiimsan RT waa daacadnimada RNA.

Kordhinta hiddaha tixraaca gudaha waxay tilmaami kartaa oo kaliya in RT guulaysatay, laakiin daruuri maahan inay la xiriirto tayada xarigga cDNA. Sababtoo ah jajabka tixraaca gudaha guud ahaan wey yar yihiin oo weynaadaan muujinta, way fududahay in lagu guuleysto qoraalka qoraalka dambe. Si kastaba ha ahaatee, cabbirka iyo muujinta hidda -wadaha la beegsanayo ayaa ku kala duwan hidde -sidaha hidde -sidaha. Tayada cDNA laguma xukumi karo tixraac gudaha ah gaar ahaan jajabyada la beegsanayo oo ka dheer 2 kb.

Shaybaarada qaarkood waxay leeyihiin qaab -dhismeedyo sare oo adag, ama leh waxyaabo GC hodan ah, ama qaali ah oo leh tiro badan. Xaaladahan, transcriptase ku habboon waa in la xushaa iyadoo la eegayo xajmiga jajabka bartilmaameedka iyo muunadda. Qaababka RNA oo leh maado sare oo GC ah iyo qaab dhismeed labaad oo adag, way adag tahay in la furo qaab -dhismeedka sare heerkul hoose, ama transcriptase caadi ah. Istaraatiijiyadan, Quant Reverse Transcriptase waa la dooran karaa, maadaama wax-ka-beddelka gadaal-ka-noqoshada sida iska cad ay ka fiican tahay tan M-MLV taxanaha transcriptase, kaas oo beddeli kara u-qori kara qaab-dhismeedyada RNA kala duwan si hufan una qori kara RNA-ga cDNA strand marka hore ilaa xadka ugu sarreeya. Markaad isticmaaleyso xirmada guud ee transcriptase, nidaamka 20 μl wuxuu si wax ku ool ah dib ugu celin karaa 1 μg ee wadarta RNA. Fadlan u fiirso awoodda ugu badan ee RT ee xirmada. Haddii qaab -dhismeedka lagu daro xad -dhaaf, qoraalka dib -u -noqoshada ayaa u roonaan doona RNA oo aad u badan. Sidaa darteed, waxaa fiican inaadan dhaafin awoodda ugu badan ee nidaamka.

A-1 Go'aami haddii RNA si xun loo bahdilay iyo haddii RT lagu guuleysto

Guud ahaan, sababta fashilka xoojinta tixraaca gudaha waxaa badanaaba sababa xaalufinta RNA ee daran. Sabab kale oo suurtogal ah ayaa ah dib -u -dhac ku -noqoshada qoraalka. Tixraaca gudaha looma adeegsan karo halbeeg lagu qiimeeyo tayada cDNA hal xarig, laakiin waxaa loo adeegsan karaa halbeeg lagu qiimeeyo haddii qoraalka dib loo rogo uu guuleysto haddii aysan dhibaato ka imaan tayada RNA. Waxa ugu muhiimsan ee habka dib -u -qorista gadaal waa in la joogteeyo heerkulka joogtada ah iyo nidaamka falcelinta joogtada ah si loo hagaajiyo hufnaanta falcelinta.

A-2 Go'aanso in aasaasayaasha xoojinta hiddaha tixraaca gudaha ay yihiin kuwo la isku halleyn karo iyo haddii ay jiraan wax dhibaato ah oo leh reagents-ka loo isticmaalo PCR.

Qiyaasida qaraabada, RNA waa in la cabiraa ka hor inta aan la qorin dib -u -celinta, taas oo sidoo kale looga baahan yahay xirmooyin badan oo dib -u -qoris ah, tusaale ahaan, qiyaasta gelinta RNA sida 1 μg. Maaddaama cDNA -ta dib loo qoraa ay tahay xal isku dhafan, oo ay ku jiraan RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, iyo xitaa wax yar oo DNA ah, weecasho ayaa sababi doonta, marka macquul ma aha in si sax ah loo qiyaaso cDNA. Sidaa darteed, qiyaasidda RNA waa lagama maarmaan. Iyada oo la tixgelinayo wax -ku -oolnimada qoraalka qoraalka ee la mid ah shaybaarada kala duwan, xaddiga cDNA ee la helay waa in ay ahaataa mid la mid ah, iyo falanqaynta tiro -koobku waxay muujin kartaa isbarbardhigga heerarka muujinta hiddo -wadayaasha kala duwan ee isla tirada guud ee RNA. Marka la samaynayo PCR -ga tirada badan ee fluorescence -ka, cDNA -ta tiro -beeleed lagama yaabo in loo baahdo ka -dib -u -qorista gadaal sababta oo ah hidda tixraaca gudaha ayaa loo dhaqmi karaa tixraac ahaan.

Waxay inta badan la xiriirtaa hidda -wadeyaasha, oo dib -u -noqoshada qayb -dheer ma aha mid suuragal u ah hidda -wadayaasha badankood. Marka hore, wax -ku -oolnimada qoraalka qoraalka ah ayaa aad uga hooseeya kan PCR. Marka labaad, gobolka hodanka ah ee GC -ga iyo qaab -dhismeedka labaad ee hidda -wadayaal badan ayaa xaddidaya qoraalka qoraalka iyo PCR labadaba. Ugu dambayntii, daacadnimada iyo hufnaanta wax -ku -oolnimada ee PCR way adag tahay in isla mar la dammaanad qaado. Geedi socodka dib -u -qorista, cidna ma dammaanad qaadi karto inay u hesho jajab dheer hiddo -wadayaasha nuqulka hooseeya, gaar ahaan adeegsiga oligo dT. Markay tahay 5 'UTR oo leh GC badan, way ka sii dhib badan tahay. Sidaa darteed, weli waa hab macquul ah oo lagu beddeli karo qoraalka oo leh astaamo aan kala sooc lahayn, laga helo goobaha kala -goynta dabiiciga ah ee jajabka bartilmaameedka ah, lagu kordhiyo qaybaha, ka dibna la sameeyo dheef -shiidka xaddidaadda iyo isku -xidhka. Guud ahaan, way adag tahay in si toos ah loo kordhiyo jajabyada ka weyn 2 kb, laakiin mar walba suurtogal ma aha in la helo: 1. Ugu horrayn, dammaanad qaadka hufnaanta RNA/mRNA, iyo soo saaridda TRIZOL ayaa la doorbidayaa. 2.M-MLV RT-PCR xirmada si toos ah ayaa loo isticmaali karaa. Si aad si habboon u kordhisid waqtiga ku -darka Haddii kale, PCR -da buulka leh ayaa la adeegsan karaa, ama fulin kartaa hal ama laba falcelin marka hore iyadoo si habboon loo fidiyay waqti -kordhin iyo waqti -kordhin ka hor inta aan la ballaarin PCR -ga caadiga ah, kaas oo gacan ka geysan kara fidinta jajabyada. U fiirso daacadnimada polymerase -ka. 3. Long Taq waxaa loo adeegsan karaa PCR si loo helo natiijooyin ku habboon. Codsiga muujinta borotiinka, polymerase aaminnimo sare waa in la adeegsadaa.

Waxaa jira laba nooc oo transcriptase ah oo ay bixiyeen TIANGEN: Quant/King RTase iyo TIANScript M-MLV. Farqiga ugu weyn ee u dhexeeya iyaga ayaa ah xaddiga gelitaanka ee sheybaarada. Quant waa transcriptase gadaal u gaar ah, oo ka duwan M-MLV sida caadiga ah loo isticmaalo oo laga soo qaatay fayraska leukemia murine ee Moloney. Quant waa transcriptase transcriptase-ka cusub oo wax-ku-ool ah oo dib-u-habayn lagu muujiyey injineernimada Escherichia coli. Quant wuxuu ku habboon yahay in la weyneeyo 50 ng-2 μg ee RNA oo leh waxqabad dib-u-qoris oo sarreeya iyo dhalid sare. Marka la barbardhigo MMLV -ga caadiga ah ama AMV, dabeecadda ugu weyn ee Quant waa inay leedahay xiriir aad u xoog badan oo leh qaab -dhismeedka RNA waxayna beddeli kartaa qaab -dhismeedyada isku -dhafan oo aan lahayn heerkulka heerkulka sare. Istaraatiijiyadaha leh GC -ga ka sarreeya, waxtarka dambe ayaa sarreeya. Si kastaba ha ahaatee, qoraalkaan gadaal -ka -noqoshada leh wuxuu leeyahay hawsha RNase H, oo laga yaabo inay saameyn ku yeelato dhererka alaabta cDNA (ku habboon <4.5 kb templates). Qoraalka guud ee caadiga ah, TIANScript MMLV transcriptase waxaa lagula talinayaa. RTase -kan waa enzim la beddelay oo leh hawl RNase H aad u daciif ah, oo ku habboon isku -darka cDNA muddo dheer (> 5 kb).

Qoraal-ka-noqoshada gadaal-ka-noqoshada ah iyo weyneynta PCR ayaa lagu dhammaystiray isla tuubada iyada oo aan la furin daboolka tuubbada u dhexeysa isku-darka cDNA iyo xoojinta, taas oo waxtar u leh yareynta faddarada. Maaddaama dhammaan shaybaarrada cDNA ee la helay loo adeegsado xoojin, xasaasiyaddu way sarraysaa, ugu yaraan 0.01 pg wadarta RNA. Si loogu guuleysto hal-talaabo RTPCR, aasaaska hiddaha-gaarka ah ayaa guud ahaan loo isticmaalaa in lagu bilaabo isku-darka cDNA. Habka laba-tallaabo ah, oo kala ah dib-u-qorista gadaal-ka-dhigga iyo weyneynta PCR ayaa lagu fuliyaa laba tallaabo. Marka hore qoraalka dib -u -noqoshada waxaa laga sameeyaa qaab -dhismeedka RNA si loo helo cDNA, cDNA -da la helayna waxaa la mariyaa hal ama in ka badan oo falcelin PCR ah. Habka laba-tallaabo wuxuu adeegsan karaa oligo (dT) ama aasaaska aan kala sooca lahayn si uu u hago isku-darka xarigga koowaad ee cDNA, wuxuuna beddeli karaa inuu ka qoro dhammaan macluumaadka mRNA muunad gaar ah.