2 Mix Isku -darka Pfu PCR

A-1 Template

Template Qaab -dhismeedka waxaa ku jira wasakhda borotiinka ama ka -hortagayaasha Taq, iwm .——- Daahiri template DNA, ka saar wasakhda borotiinka ama soo saar DNA -da template oo leh xirmooyin nadiifin ah.

Diidmada qaab -dhismeedku ma dhammaystirna ——-In si habboon loo kordhiyo heerkulka denaturation -ka oo la dheereeyo waqtiga wax -soo -saaridda.

Deg Hoosudhaca Template ——Dib u diyaari template-ka.

A-2 Primer

Quality Tayada liidata ee raasamayaasha ——Dib-isugu-dar-darreeyaha.

Rad Hoos -u -dhac horudhac ah ——Waxaad u dhigtaa aasaaska fiirsashada sare mugga yar si loo ilaaliyo. Ka fogow baraf badan iyo dhalaalid ama 4 ° C cryopreserved.

Design Naqshadeynta aan fiicnayn ee raasamaalka (tusaale.

A-3 Mg²⁺foojignaan

■ Mg²⁺ feejignaanta ayaa aad u yar ——Si fiican u kordhi Mg²⁺ feejignaanta: Hagaajinta Mg²⁺ ku -uruurinta falcelinno taxane ah oo ka bilaabma 1 mM illaa 3 mM oo u dhexeysa 0.5 mM si loo go'aamiyo Mg -ga ugu habboon²⁺ xoojinta template kasta iyo hordhac.

A-4 Heer kululaynta

Temperature Heerkulka ku -shubista oo sarreeya wuxuu saameeyaa ku -xidhmidda aasaaska iyo tusaalaha. ——Soo yaree heerkulka sifeynta oo aad ku wanaajiso xaaladda iyadoo leh weji 2 ° C ah.

A-5 Waqtiga Kordhinta

Time Wakhti kordhinta oo gaaban —— Kordhi wakhtiga kordhinta.

Phenomena: Shaybaarada taban ayaa sidoo kale muujinaya kooxaha taxanaha bartilmaameedka ah.

A-1 Faddaraynta PCR

Ka gudubta isku xigxiga bartilmaameedka ama alaab -weyneynta ——- Si taxaddar leh ha ugu shubin saambalka ay ku jiraan isku xigxiga bartilmaameedka muunadda taban ama ka daadi tuubada centrifuge -ga. Soo -saareyaasha ama qalabka waa in si otomaatig ah loo xiro si loo baabi'iyo asiidhka nucleic ee jira, iyo jiritaanka faddaraynta waa in lagu go'aamiyaa tijaabooyinka xakamaynta xun.

Contamin Faddaraynta reagent ——Soo celi reagentyada oo ku kaydi heerkul hoose.

A-2 Ra'iisulr

■ Mg²⁺ feejignaanta ayaa aad u yar ——Si fiican u kordhi Mg²⁺ feejignaanta: Hagaajinta Mg²⁺ ku -uruurinta falcelinno taxane ah oo ka bilaabma 1 mM illaa 3 mM oo u dhexeysa 0.5 mM si loo go'aamiyo Mg -ga ugu habboon²⁺ xoojinta template kasta iyo hordhac.

Design Naqshadaynta asaasiga ah ee aan habboonayn, iyo taxanaha bartilmaameedka ayaa leh isbarbardhig leh isku xigxiga aan bartilmaameedka ahayn. —— Dib-u-naqshadeeyayaasha naqshadeynta.

Phenomena: Kooxaha kor u qaadista PCR-ku ma waafaqsana cabbirka la filayo, ha weynaado ama ha yaraado, ama mararka qaarkood labada qaybood ee xoojinta gaarka ah iyo guutooyinka xoojinta aan gaarka ahayn ayaa dhaca.

A-1 Horudhac

Specific Tilmaamid asaasi ah oo liidata

—— Dib-u-naqshadeynta asaasiga ah.

Concentration Feejignaanta asaasiga ahi aad bay u sarraysaa ——Si fiican u kordhi heerkulka denaturation -ka oo sii dheeree waqtiga dheellitirka.

A-2 Mg²⁺ foojignaan

M Mg²⁺ feejignaanta ayaa aad u sareysa ——Si fiican u yaree feejignaanta Mg2+: Hagaaji Mg²⁺ ku -uruurinta falcelinno taxane ah oo ka bilaabma 1 mM illaa 3 mM oo u dhexeysa 0.5 mM si loo go'aamiyo Mg -ga ugu habboon²⁺ xoojinta template kasta iyo hordhac.

A-3 Polymerase Thermostable

Amount Qaddarka enzme -ka xad -dhaafka ah——Soo yaree xaddiga enzyme si habboon oo u dhexeeya 0.5 U.

A-4 Heer kululaynta

Temperature Heerkulka ku-shubista ayaa aad u hooseeya ———In si habboon loo kordhiyo heerkulka daboolidda ama la qaato habka laba-wajiye

A-5 wareegyada PCR

Cy Wareegyo PCR aad u badan ——Soo yaree tirada wareegyada PCR.

A-1 Horudhac—— Tilmaamid liidata —— Dib-u-naqshadee horudhaca, beddel booska iyo dhererka astaanta si kor loogu qaado gaar ahaanshaheeda; ama samayso PCR buul ah.

A-2 Template DNA

—— Qaab -dhismeedka ma aha mid daahir ah ——Ku nadiifi template -ka ama ka soo saar DNA -da xirmooyinka is -daahirinta.

A-3 Mg²⁺ foojignaan

——Mg²⁺ feejignaanta ayaa aad u sareysa ——Si fiican u yaree Mg²⁺ feejignaanta: Hagaajinta Mg²⁺ ku -uruurinta falcelinno taxane ah oo ka bilaabma 1 mM illaa 3 mM oo u dhexeysa 0.5 mM si loo go'aamiyo Mg -ga ugu habboon²⁺ xoojinta template kasta iyo hordhac.

A-4 dNTP

—— Ku -uruurinta dNTP -yada aad ayay u sarraysaa ——Si habboon u yaree uruurinta dNTP

A-5 Heerkulbeeg

—— Heerkulka dabaysha oo aad u hooseeya ——- Si habboon u kordhi heerkulka dabaysha

A-6 Wareegyo

——Toolooyin badan ——Ku hagaaji lambarka wareegga

Tallaabada ugu horreysa waa inaad doorato polymerase habboon. Polymerase-ka caadiga ah ee Taq ma caddeyn karo sabab la xiriirta la'aanta waxqabadka 3'-5 ', iyo isku-dheelitir la'aantu waxay si weyn u yareyn doontaa wax-qabadka fidinta ee jajabyada. Sidaa darteed, polymerase -ka caadiga ah ee Taq si fiican uma kordhin karo jajabyada bartilmaameedka ee ka weyn 5 kb. Taq polymerase oo leh wax -ka -beddel gaar ah ama polymerase -ka kale ee aaminnimada sare leh waa in la xushaa si loo hagaajiyo hufnaanta fidinta oo loo daboolo baahiyaha ballaarinta jajabka dheer. Intaa waxaa dheer, xoojinta jajabyada dhaadheer sidoo kale waxay u baahan tahay hagaajin u dhiganta naqshadeynta asaasiga ah, waqtiga kala-soocidda, waqtiga kordhinta, pH-ka, iwm. Si looga hortago waxyeellada template, waqtiga denaturation -ka ee 94 ° C waa in lagu yareeyaa 30 seken ama ka yar wareeg kasta, iyo waqtiga heerkulka kor loogu qaadayo 94 ° C ka hor intaan la weyneyn waa inuu ka yaraadaa 1 min. Intaa waxaa dheer, dejinta heerkulka fidinta qiyaastii 68 ° C iyo naqshadeynta waqtiga kordhinta iyadoo la raacayo xaddiga 1 kb/min waxay xaqiijin kartaa xoojinta waxtarka leh ee jajabyada dhaadheer.

Heerka qaladka ee weyneynta PCR ayaa la dhimi karaa iyadoo la adeegsanayo polymerases DNA kala duwan oo leh aaminnimo sare. Waxaa ka mid ah dhammaan polymerase -ka Taq DNA ee la helay, Pfu enzyme wuxuu leeyahay heerka qaladka ugu hooseeya iyo daacadnimada ugu sareysa (eeg shaxda ku lifaaqan). Ka sokow xulashada enzyme, cilmi -baarayaashu waxay sii yareyn karaan heerka is -beddelka PCR iyagoo hagaajinaya xaaladaha falcelinta, oo ay ku jiraan hagaajinta halabuurka, xoojinta polymerase -ka heerkulka leh iyo hagaajinta lambarka wareegga PCR.