Xirmadda Maktabadda DirectFast ee TIANSeq (illumina)

Waqtigan xaadirka ah, teknolojiyadda isku xigxiga ee wax-soo-saarka sare waxay inta badan ku saleysan tahay teknolojiyadda isku xigxiga jiilka xiga. Maaddaama dhererka akhriska ee tiknoolijiyada isku xigxiga jiilka soo socda uu xadidan yahay, waa in aan jebinnaa isku xigxiga dhererka oo dhan maktabadaha jajabka ah si aan isku xigxigno. Marka loo eego baahiyaha tijaabooyinka isku xigxiga ee kala duwan, inta badan waxaan doorannaa isku xigxiga hal-dhammaadka ah ama isku xigxiga laba-geesoodka ah. Hadda jajabyada DNA ee maktabadda isku xigxiga jiilka soo socda ayaa guud ahaan loo qaybiyaa inta u dhaxaysa 200-800 bp.

a) DNA -da tayadiisu aad bay u liidataa waxaana ku jira xannibayaal. Isticmaal shay-baarka DNA-ga oo tayo sare leh si aad uga fogaato in la joojiyo dhaqdhaqaaqa enzyme.

b) Qaddarka saamiga DNA-ga kuma filna marka la isticmaalayo hab PCR-ka-la'aan ah si loo dhiso maktabadda DNA. Marka gelinta DNA-da kala qaybsan ay ka badato 50 ng, socodka shaqada PCR-la'aanta ah ayaa si xushmad leh loo samayn karaa inta lagu jiro habka dhismaha maktabadda. Haddii nuqulka nuqulka maktabaddu uu aad u hooseeyo oo aan si toos ah loo kala xigin, maktabadda DNA -ga waxaa sii ballaarin kara PCR ka dib isku -xidhka adabtarada.

c) Faddaraynta RNA waxay horseedaa qiyaasta DNA -da bilowga ah oo aan sax ahayn Faddaraynta RNA ayaa laga yaabaa inay ku jirto habka daahirinta DNA -da hidde -wadaha, taas oo horseedi karta qiyaasta DNA -da oo aan sax ahayn iyo ku -filnaanshaha DNA -ga oo ku filan inta lagu jiro dhismaha maktabadda. RNA waxaa laga saari karaa iyadoo lagu daaweeyo RNase.

A-1

a) Jajabyo yaryar (60 bp-120 bp) ayaa u muuqda jajabyo yaryar badiyaa waa jajabyo adabtarada ama dimers oo ay sameeyeen adapters-ku. Ku daahirinta Agencourt AMPure XP kuullada birlabka ayaa si wax ku ool ah uga saari kara jajabyada adabtarada oo hubin kara tayada isku xigxiga.

b) Jajabyo waaweyn ayaa ka soo muuqda maktabadda ka dib markii la kordhiyay PCR Cabbirka jajabka DNA -ga maktabadda ayaa ku kordhaya 120 bp ka dib marka adabtarada la xidho. Haddii jajabka DNA -ga uu ku bato wax ka badan 120 bp ka dib isku -xidhka adabtarada, waxaa laga yaabaa inay sababto kor -u -qaadis aan caadi ahayn oo ah ballaarinta PCR ee xad -dhaafka ah. Yaraynta tirada wareegyada PCR waxay ka hortagi kartaa xaaladda.

c) Cabbirka aan caadiga ahayn ee jajabka DNA -ga maktabadda kadib isku -xidhka adabtarada Dhererka adabtarada ee xirmadaan waa 60 bp. Marka labada daraf ee jajabku ku xidhmaan adaporka, dhererku wuxuu kordhayaa oo kaliya 120 bp. Markaad isticmaasho adabtarada aan ahayn tan uu xirmadani bixiyay, fadlan la xiriir alaab -qeybiyaha si aad u siiso macluumaad khuseeya sida dhererka adabtarada. Fadlan hubi in socodka shaqada iyo hawlgalka tijaabada ay raacaan talaabooyinka lagu tilmaamay buug -gacmeedka.

d) Cabbirka jajabka DNA -ga oo aan caadi ahayn ka hor isku xidhka adabtarada Sababta dhibaatadan waxaa sababi kara xaalado falcelin oo khaldan inta lagu jiro kala qaybsanaanta DNA. Waqtiyada falcelinta kala duwan waa in loo adeegsadaa soo gelinta DNA ee kala duwan. Haddii gelinta DNA ay ka badan tahay 10 ng, waxaan kugula talineynaa inaad dooratid waqtiga falcelinta 12 min oo ah waqtiga bilowga ee wanaajinta, iyo cabirka jajabka ee la soo saaray waqtigan inta badan wuxuu u dhexeeyaa 300-500 bp. Isticmaalayaasha waxay kordhin karaan ama yareyn karaan dhererka jajabka DNA 2-4 min iyadoo la raacayo shuruudaha iyaga u gaarka ah si kor loogu qaado jajabka DNA oo leh cabbirka loo baahan yahay.

A-2

a) Waqtiga kala -jajabinta lama hagaajin Haddii DNA -da kala firidhsan ay aad u yar tahay ama aad u weyn tahay, fadlan tixraac Tilmaamaha Xulashada Waqtiga Kala -jajabinta ee lagu siiyay tilmaanta si loo go'aamiyo waqtiga falcelinta, oo u isticmaal barta waqtigaan sidii kontorool, sidoo kale samee nidaamka falcelinta si loo dheereeyo ama loo soo gaabiyo 3 min si loo sameeyo sixitaan sax ah waqtiga kala qaybsanaanta.

A-3

Qaybinta cabbirka aan caadiga ahayn ee DNA ka dib daaweynta kala -goynta

a) Habka dhalaaleynta oo aan sax ahayn ee reagent -kala -jajabinta, ama reagent -ka si buuxda iskuma dhafan ka dib dhalaalid. Dhalaali 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagent on baraf. Marka la dhalaaliyo, reagent -ka isku walaaq adigoo si tartiib ah u garaacaya tuubada hoosteeda. Ha ku wareejin reagent -ka!

b) Muunadda gelinta DNA -ga waxaa ku jira EDTA ama wasakh kale Haddii DNA lagu kala diro 1 × TE, isticmaal habka lagu bixiyay tilmaanta si aad u samayso kala qaybsanaan. Haddii xoogga EDTA ee xalka aan la hubin, waxaa lagu talinayaa in la nadiifiyo DNA -ga oo lagu kala diro biyo la kala -gooyay si falcelin dambe loo helo.

c) Qiyaasta DNA -da bilowga ah oo aan sax ahayn Cabbirka DNA -da kala qaybsan waxay si dhow ula xiriirtaa xaddiga gelinta DNA. Ka hor inta aan la daweyn kala -goynta, qiyaasidda saxda ah ee DNA -da iyadoo la adeegsanayo Qubit, Picogreen iyo habab kale ayaa lama huraan u ah in la go'aamiyo xaddiga saxda ah ee DNA ee nidaamka falcelinta.

 d) Diyaarinta nidaamka falcelintu ma raacdo tilmaamaha Diyaarinta habdhiska falcelinta jajaban waa in lagu fuliyaa barafka si waafaqsan tilmaamaha. Si loo hubiyo saamaynta ugu fiican, dhammaan qaybaha falcelinta waa in lagu meeleeyaa barafka iyo diyaarinta habka falcelinta waa in la sameeyaa ka dib qaboojin buuxda. Ka dib marka diyaarinta la dhammeeyo, fadlan ku dhufo ama dhufo si aad si fiican isugu qasto. Ha ku wareejin!

1. Habka isku dhafka oo aan habboonayn (vortex, oscillation rabshad leh, iwm.) Ayaa sababi doonta qaybin aan caadi ahayn oo jajabyada maktabadda ah (sida ka muuqata shaxda soo socota), sidaasna waxay saamayn ku yeelan doontaa tayada maktabadda. Sidaa darteed, marka aad diyaarinayso xalka falcelinta Isku -darka, fadlan si tartiib ah kor iyo hoos ugu dhufo si aad isugu qasto, ama u isticmaal fartaada si aad u leexiso oo aad isku qasto. Ka taxaddar inaadan ku dhex qasin vortex.

2. Hufnaanta sare ee DNA waa in loo adeegsadaa dhismaha maktabadda

Hufnaanta DNA -da Wanaagsan: Kooxda electrophoresis waxay ka badan tahay 30 kb, oo aan lahayn dabada

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. Qadarka gelinta DNA waa inuu ahaadaa mid sax ah Waxaa la soo jeediyay in la isticmaalo hababka Qubit iyo PicoGreen si loo qiyaaso DNA, halkii laga isticmaali lahaa Nanodrop.

4. Waxa ku jira EDTA ee ku jira xalka DNA waa in la go'aamiyaa EDTA waxay saamayn weyn ku leedahay falcelinta tafaraaruqa. Haddii waxa ku jira EDTA ay sarreeyaan, nadiifinta DNA -ga ayaa loo baahan yahay in la sameeyo ka hor baaritaanka xiga.

5. Xalka falcelinta kala -jajabinta waa in lagu diyaariyaa barafka Habka kala -qaybsanaantu waxay u nugul tahay heerkulka falcelinta iyo waqtiga (gaar ahaan marka lagu daro xoojiye). Si loo hubiyo sax ahaanshaha waqtiga falcelinta, fadlan u diyaari nidaamka falcelinta barafka.

6. Wakhtiga falcelinta kala -qaybsanaantu waa inuu ahaadaa mid sax ah Waqtiga falcelinta ee tallaabada kala -jajabintu waxay si toos ah u saamayn doontaa baaxadda alaabta jajabka ah, taasoo saamaynaysa baaxadda qaybinta jajabka DNA ee maktabadda.

1. Noocee muunad ah ayaa lagu dabaqi karaa xirmadaan?

Nooca muunad ee la adeegsan karo ee xirmadaan wuxuu noqon karaa wadar ahaan RNA ama mRNA la sifeeyay oo leh hufnaan RNA oo wanaagsan. Haddii wadarta RNA loo isticmaalo dhisidda maktabadda, waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo xirmada xaalufinta rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391) si meesha looga saaro rRNA marka hore.

2. Saamiyada FFPE ma loo isticmaali karaa in lagu dhiso maktabad xirmadaan?

MRNA ee shay -baarka FFPE ayaa hoos loo dhigi doonaa ilaa xad, iyadoo daacadnimo xumo liidata. Markaad u adeegsanayso qalabkan dhismaha maktabadda, waxaa lagugula talinayaa inaad hagaajiso waqtiga kala -qaybsanaanta (gaabin waqtiga kala -jajabinta ama aadan fulin kala -jajabinta).

3. Adigoo adeegsanaya tallaabada xulashada cabbirka ee lagu bixiyay buugga badeecadda, maxaa sababi kara in qaybta la galiyay ay u muuqato leexasho yar?

Xulashada cabbirka waa in loo fuliyaa si adag oo waafaqsan tallaabada xulashada cabbirka ee buuggan wax -soo -saarka. Haddii ay jirto leexasho, sababtu waxay noqon kartaa in kuullada magnetic -ku aysan isku dheelitirnayn heerkulka qolka ama aysan si buuxda isugu qasanayn, dhuumaha sax ma aha ama dareeraha ayaa ku haray caarada. Waxaa lagugula talinayaa inaad isticmaasho talooyinka leh xayeysiin hooseysa tijaabada.

4. Xulashada adaporka dhismaha maktabadda

Xirmada dhismaha maktabadda kuma jirto reagent adapter, waxaana lagu talinayaa in la isticmaalo xirmadaan oo ay la socoto TIANSeq Adap-Single Index (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC ee maktabadda

Ogaanshaha tirada maktabadda: Qubit iyo qPCR waxaa loo isticmaalaa in lagu go'aamiyo isu -uruurinta ballaaran iyo uruurinta maktabadda siday u kala horreeyaan. Hawlgalku wuxuu si adag u waafaqsan yahay buuga wax soo saarka. Uruurinta maktabadda ayaa guud ahaan buuxin doonta shuruudaha isku xigxiga NGS. Ogaanshaha baaxadda qaybinta maktabadda: Isticmaalka Agilent 2100 Bioanalyzer si loo ogaado baaxadda qaybinta maktabadda.

6. Xulashada lambarka wareegga xoojinta

Sida ku cad tilmaamaha, tirada wareegyada PCR waa 6-12, iyo tirada wareegyada PCR ee loo baahan yahay waa in lagu xushaa iyadoo loo eegayo talooyinka tusaalaha. Maktabadaha wax-soo-saarkoodu sarreeyo, kor-u-qaadista badiyaa waxay ku dhacdaa heerar kala duwan, taas oo lagu muujiyo xoogaa xoogaa ka weyn ka dib marka ugu sarreysa ee bartilmaameedka lagu ogaado Agilent 2100 Bioanalyzer, ama fiirinta la ogaaday ee Qubit ayaa ka hooseeya tan qPCR. Dhex -dhexaadinta oo aad u fudud ayaa ah dhacdo caadi ah, taas oo aan saamaynayn isku xigxiga maktabadda iyo falanqaynta xogta ku xigta.

7. Spikes waxay ka muuqataa astaanta ogaanshaha Agilent 2100 Bioanalyzer

Muuqashada dhirbaaxooyinka ee Agilent 2100 Ogaanshaha Bioanalyzer waxaa sabab u ah kala -soocid la'aanta shaybaarka, halkaas oo ay ku jiri doonaan jajabyo badan oo cabbir gaar ah leh, tanina waxay sii caddaan doontaa ka dib kobcinta PCR. Xaaladdan oo kale, waxaa la soo jeedinayaa in aan la samayn xulashada cabbirka, yacni u dhig xaaladda kala -jajabinta 94 ° C muddo 15 min ah oo la shubay, halkaas oo qaybinta jajabka ay yar tahay oo urursan tahay, iyo isku -ekaanshaha waa la hagaajin karaa.